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丙烯酰胺凝胶一定要加四甲基乙二胺吗

来源:www.dbkyw.com   时间:2023-02-15 18:26   点击:102  编辑:admin   手机版

不是的。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种载体介质上,可以根据被分离物质的分子大小和分子电荷进行分离。

聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点:

①聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺与N,N'亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的高分子。凝胶晶格是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少有离子侧基,因此电渗效应较小,不易与样品发生相互作用。

②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种合成物质,聚合前可以调节单体的浓度比,形成不同程度的交联结构,其孔隙率可以在很大范围内变化,根据根据被分离物质分子的大小,可以选择合适的凝胶成分,使其既具有合适的孔隙率,又具有较好的力学性能。

一般来说,含7-<@​​7.5%丙烯酰胺的凝胶具有适合分离分子量从到100万的物质的机械性能,对于以下的蛋白质,使用15-30%丙烯酰胺凝胶,含4%丙烯酰胺的凝胶可用于特别大的分子量。大孔胶易碎,小孔胶很难从管子中取出。因此,当丙烯酰胺的浓度增加时,可以减少双含凝胶。丙烯酰胺改善凝胶的力学性能。

③在一定浓度范围内具有热稳定性聚丙烯酰胺。凝胶无色透明,易于观察,可直接用检测器测量。

④丙烯酰胺是一种比较纯的化合物,可以通过精制来减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺。丙烯酰胺称为单体,甲基双丙烯酰胺称为交联剂。在水溶液中,单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。

在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中,需要催化剂,催化剂包括引发剂和促进剂两部分。引发剂在凝胶形成过程中提供初始自由基,通过自由基的传递,丙烯酰胺变成自由基开始聚合反应,促进剂可以加快引发剂的自由基释放速度。常用引发剂和促进剂的相容性如下:

聚合催化剂相容性

发起者

加速器

(NH4)

(NH4)

核黄素

注:(NH4),过硫酸铵:N,N,N,N';四甲基乙二胺:β-二甲氨基丙氨酸过硫酸铵引发的反应称为化学聚合;核黄素引发的反应溶液需要被强光照射,称为光聚合。聚丙烯酰胺聚合受以下因素影响:

1、大气中的氧气可以淬灭自由基,终止聚合反应,因此在聚合过程中应将反应液与空气隔离。

2、某些材料,例如有机玻璃,会抑制聚合。

3、某些化学物质,例如红血盐,可以减缓反应。

4、高温聚合快,低温聚合慢。制备凝胶时必须考虑以上几点。凝胶的网目尺寸、机械强度和透明度很大程度上取决于凝胶的浓度和交联度。每100毫升凝胶溶液中所含单体和交联剂的总克数称为凝胶浓度,常用T%表示;连通性,通常以C%表示,可以通过以下公式计算:

公式

a:丙烯酰胺的克数; b:亚甲基二丙烯酰胺的克数; m:缓冲液体积(ml) 凝胶浓度过高时聚丙烯酰胺凝胶电泳仪,凝胶硬而脆,易破裂;凝胶浓度过低,凝胶较软,不易操作。

交联度太高,凝胶不透明,不灵活;交联度太低,凝胶糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度,它不会阻止对流降低扩散能力,而且由于它具有三维网络结构,分子通过该网络的能力将取决于凝胶孔隙率和分离物质颗粒的大小和形状,这就是凝胶的分子筛分作用。

由于这种分子筛效应,这里的凝胶不仅仅是一种纯载体。因此,电泳时除了要注意电泳的基本原理外,还要注意与凝胶本身有关的各种性质(网孔大小和形状等)。可通过下式选择合适的凝胶目数。

公式

式中:P为网孔的平均直径聚氯化铝,C为聚合物浓度,d为聚合物的分子直径(如果不是卷曲分子,则应为5A),K为常数, K的值取决于橡胶的溶胀量。几何构型,如果聚合物的链以近似直角交联,大约为1.5 根据这个公式,我们可以通过聚合物浓度C来近似计算网格直径,例如,一直知道聚合物浓度为5%,网眼的平均直径应该是:

公式

这样的计算是粗略的,与实际情况有一定的距离。有人测得丙烯酰胺溶液的总浓度(T)为20%。在六种不同比例的双丙烯酰胺存在下聚丙烯酰胺凝胶电泳仪,聚合后的网目尺寸。

发现孔径与总浓度有关。总浓度越大,孔径越小,机械强度越强。当总浓度不变时,Bis浓度为5%时亚甲基双丙烯酰胺(Bis)的孔径最小,高于低于此值时,聚合物孔径变大,凝胶孔径是凝胶电泳中的一个重要参数,往往决定着电泳的分离效果。

经过不断的实践,得到了如表3所示的经验值。一般来说,体内大多数蛋白质使用浓度为<@7.5%的凝胶,电泳结果往往令人满意。 ,所以这种浓度组成的凝胶称为“标准凝胶”。

对于那些用于关键研究的凝胶,最好通过一系列 10% 的凝胶浓度阶梯进行预测试来选择最佳凝胶浓度。

表3 不同分子量范围的蛋白质和核酸在凝胶电泳中的凝胶浓度百分比

物质

分子量范围

适用凝胶浓度(%)

蛋白质

5×105

20-30 15-20 10-15 5-10 2-5

核酸

10-20 5-10 2-3.6

聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续和不连续两类。前者是指整个电泳系统中使用的缓冲液,pH值和凝胶目数相同,后者是指电泳系统中使用的两种或两种以上的缓冲液,pH值和孔径。间断电泳可以在电泳过程中将稀释的样品浓缩成层,从而提高分辨能力。

当蛋白质在 聚丙烯酰胺 凝胶中进行电泳时,其迁移率取决于其净电荷以及分子大小和形状等因素。如果加入试剂消除电荷因子,电泳迁移率取决于分子的大小,通过电泳可以确定蛋白质的分子量。 1967年等人发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有此作用。

当向蛋白质溶液中加入足量的 SDS 和巯基乙醇时,SDS 可以减少蛋白质分子中的二硫键。由于十二烷基硫酸盐的负电荷,各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其量大大超过原始蛋白质分子的电荷量,从而掩盖了不同蛋白质之间的原始差异。电荷的差异也会引起SDS与蛋白质结合后的构象变化。

蛋白质-SDS 复合物形成一个近似“雪茄”形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度不同,约为18A。这种蛋白质-SDS复合物在凝胶中。蛋白质的迁移率不再受原始蛋白质的电荷和形状的影响,而是取决于分子量的大小,因此可以使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定蛋白质的分子量

聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。 丙烯酰胺与BIS (N, N’ C 亚甲双丙烯酰胺...

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